代謝副產物乙酸對大腸桿菌發酵的影響及解決方法

生物技術研究者追求的兩個主要目標，一是新型生物產品的開發，另一就是為傳統的或新生生物產品，尋求更經濟的生產方式。近十年來，利用遺傳工程技術來生產一些重要的生物藥物，是生物技術領域中迅速發展的一個重要方向。在這一研究領域里，如何創造更經濟、更有效的方法，來提高生產過程的經濟性和產品的市場競爭力，已經成為生物技術領域的科學家們所關注的焦點問題。
   利用重組DNA技術生產重要的生物藥物，在人類文明史上具有劃時代的意義。由于生產成本和生產率的高低直接影響公司的生存，重組生物藥物生產過程的優化已經成為一個重要問題。它包括以下六個方面∶(1)適宜宿主的選擇；(2)重組蛋白積累位點(如可溶的胞內積累、胞內聚合積累、周質積累或胞外積累)的確定；(3)重組基因最大表達的分子策略；(4)細胞生長和生產環境的優化；(5)發酵條件的優化；后處理過程的優化。只有這六個方面都以實現高生產率為目標，整個生產過程的最優化才能實現。

(一)細胞生長環境的優化策略
要提高細胞密度和生產率，首先需要對微生物生長的物理和化學環境進行優化，包括生長培養基的組成，培養物理參數(pH、溫度和攪拌)及產物誘導條件。優化這些參數的目的在于保證細胞生長處于最適的環境條件之下，避免營養物過量或不足、防止產物降解以及減少有毒產物的形成。
1．培養基組成的優化
培養基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微營養物如維生素和微量元素，這些營養物的濃度與比例，對實現生產重組微生物的高密度發酵是很重要的。例如，過量的Fe2+和CaCO3與相對低濃度的磷酸鹽可促進黃曲霉生產L-蘋果酸；鏈霉菌在60～80 mmol/L CO32-存在下，其絲氨酸蛋白酶生產能力可提高10倍之多；在重組微生物達到高細胞密度后，限制磷酸鹽濃度可使抗生素和異源白介素b的產率顯著提高。此外還發現，限制精氨酸的濃度雖然會抑制細胞的生長，但比起精氨酸充足時細胞生長優良的情況，其重組a-淀粉酶的產量可提高2倍。
培養基中復合氮源的種類對重組大腸桿菌的高密度發酵也非常重要。一般地，當流加培養基中含有酵母膏時，重組蛋白不穩定；而當流加培養基中含有蛋白胨時，大腸桿菌不能再利用其所產生的乙酸。將酵母膏和蛋白胨都加入流加培養基中，不但所生產的重組蛋白非常穩定，細胞還能再利用代謝合成的乙酸，這是一種非常有趣的代謝機制。
恒化技術可用于優化精氨酸營養缺陷型大腸桿菌X90的生長培養基。使該菌株以0.4 h-1的比生長速率在含精氨酸的基本培養基上生長，待培養達到穩定狀態后，在恒化器內分別加入氨基酸、維生素和微量元素來考察這些物質對菌體生長和精氨酸合成的影響。結果表明，由于氨基酸生物合成途徑的末端產物抑制作用，加入某些氨基酸后，細胞生長反而受到抑制。加入NH4Cl后細胞量則出現了戲劇性的增長。而添加維生素對菌體生長基本上沒有任何影響。通過計算生物量對每種基質的產率，最終可以確定高密度發酵培養基的組成，在此優化培養基上，大腸桿菌X90細胞密度可達到92 g/L，同時形成56 mg/L的胞外重組蛋白酶。
2．特殊營養物的添加
在某些情況下，向培養基中添加一些營養物質能提高生產率。這些營養物的作用有可能是作為產物的前體，也有可能是阻止產物的降解，例如，在培養重組大腸桿菌生產氯霉素乙酰轉移酶(一種由許多芳香族氨基酸組成的蛋白)時添加苯丙氨酸，可將酶的比活力提高大約2倍；在培養重組枯草芽孢桿菌生產b-內酰胺酶的培養基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸鉀能使重組蛋白的穩定性顯著提高。其原因可能是由于宿主細胞產生的多種胞外蛋白酶的活性被抑制，從而防止了重組蛋白的降解。
在生長培養基中添加特殊物質有時還能以一種未知的機制提高生產率。例如，在搖瓶培養Micromonospora cbersina時添加碘化鈉可使dynemicin A的產量提高35倍，但在小型反應器中卻無法重復這一結果。
3．限制代謝副產物的積累
培養條件的控制對代謝副產物的形成影響甚大。在分批或流加培養中，某些營養物的濃度過高均會導致Crabtree效應的產生。在這種效應下，釀酒酵母會產生乙醇，大腸桿菌則會產生過量乙酸，一旦生成乙酸，細胞生長及重組蛋白的生產均會受到抑制。大腸桿菌形成乙酸的速度依賴于細胞的生長速度和培養基的組成。業已確證，如果在培養基中添加復合營養物(如大豆水解物)，則會增加乙酸的積累量。針對如何減輕由于乙酸積累而產生的負面影響，眾多研究者進行了大量工作，如利用循環發酵技術來限制乙酸在重組大腸桿菌高密度培養中的積累。近來也有研究表明，添加某些氨基酸能減輕乙酸的抑制作用。如在培養基中添加10 mg/L的甘氨酸能顯著促進大腸桿菌合成重組a-淀粉酶和b-內酰胺酶，并能刺激酶從周質向培養基中釋放，但此時仍有乙酸伴隨生成。
 

(二)培養模式

由于許多營養物在高濃度下對細胞有抑制作用，而為了達到高細胞密度，又必須供給大量的營養物質，因此，濃縮營養物必須以與其消耗速率成比例的速度加入反應器中。為此產生了多種形式的補料策略，它可以簡單到線性補料，也可以復雜到利用數學模型計算得出的策略來控制補料速率。具體來說，培養模式的選擇主要依賴于以下三個因素∶(1)所培養細胞的具體代謝行為；(2)利用抑制性底物合成目的產物的潛力；(3)誘導條件以及測量細胞培養各項參數的能力。
1．大腸桿菌流加發酵策略
大腸桿菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，廣泛用于基因工程的研究中。大腸桿菌高密度培養時最關鍵的問題是如何盡量減少乙酸的產生，因為高濃度葡萄糖或高比生長速率帶來的高濃度乙酸會嚴重抑制細胞生長和重組蛋白的生產。研究發現，即使葡萄糖濃度只有0.25～0.5 g/L，大腸桿菌仍會產生乙酸。因此，高細胞密度發酵所采用的流加策略必須按照一定的算法制定，以保持反應器中底物濃度處于較低的水平。營養物最好以它們的消耗速率加入反應器中，這樣不僅可以防止底物積累到毒性水平，也不會使細胞處于饑餓狀態。
近年來已經報道了多種控制大腸桿菌流加培養中流加速率的方法，其中大多數是將流加速率與一種物理參數間接耦合(如溶氧、pH或CO2釋放速率)。有學者將溶氧控制在一個預定值上以保證較低的生長速率，結果乙酸產生很少，最終細胞干重達到110 g/L，并發現較低的比生長速率還有利于重組蛋白的高表達。在另一個控制低比生長速率的高細胞密度培養中，研究者采用先指數流加葡萄糖、銨鹽和無機鹽，后采用廣義線性流加的培養策略，有效地防止了乙酸的積累，重組大腸桿菌的細胞密度達到66 g/L，通過溫度誘導可在胞內形成19.2 g/L的活性重組蛋白。
如果將葡萄糖濃度控制在一個不致于產生毒性的足夠低的水平上，也可以使細胞在不存在限制性基質的情況下迅速生長到高細胞密度。這種控制策略對儀器的要求較高。Kleman等采用在線葡萄糖分析儀，以微生物對葡萄糖的需求來決定葡萄糖和其它營養物的流加速率，這一算法能夠在產物誘導階段中根據細胞生長的變化自動調整流加速率。培養攜帶質粒的大腸桿菌 MV1190，其質粒中帶有編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最終細胞干重達到39 g/L，產生1.7 g/L可溶的活性蛋白。
2．重組酵母的流加發酵
酵母中廣泛用于遺傳工程研究的菌株是釀酒酵母。但采用釀酒酵母作為重組宿主也有以下缺點∶(1)重組蛋白生產的水平較低；(2)質粒不穩定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出現的，因為這會抑制重組蛋白的形成。近來研究表明，其它酵母，如巴斯德畢赤氏酵母也具有作為重組宿主的潛力。Clare等比較了重組巴斯德畢赤氏酵母和釀酒酵母在高細胞密度狀態下表達和分泌鼠表皮生長因子的能力。培養每基因組含有19個拷貝數的巴斯德畢赤氏酵母，最終可獲得447 mg/L胞內重組蛋白；而培養釀酒酵母所獲得的最高水平僅6～7 mg/L。
通過先指數流加，后采用基于CO2釋放和RQ值的線性流加控制方式可使重組巴斯德畢赤氏酵母的細胞干重達到80～90 g/L，并分泌高水平的重組人血清蛋白。而培養釀酒酵母，細胞干重和重組蛋白的產量僅分別為25 g/L和20 mg/L。即使將釀酒酵母的生長速率維持在0.12～0.18 h-1，也將形成10～13 g/L的乙醇，因而導致產率降低。但釀酒酵母產乙醇也并不是不可控制的。Shimizu等采用一個復雜的流加系統，將酵母的生長速率控制在0.3 h-1，可使谷胱甘肽(GSH)的生產最大而乙醇的生成最小。
3．流加培養的控制
一個好的流加控制系統必須避免兩種傾向∶一是流加過量，補料組分在反應器中積累從而對細胞生長和產物形成產生抑制；二是流加不足，這可能會導致細胞必需營養物的缺乏。計算機技術的迅猛發展，為流加培養的控制提供了更有效的手段。近年來，應用計算機技術來監測和控制發酵過程的研究屢見報道。由于現代計算機技術的幫助，人們能夠采用多種生長參數和數學模型來控制流加培養中營養物的添加，從而使復雜的控制系統得以實現。在各種人工智能技術中，模糊推理(fuzzy reasoning)是應用最廣的一種。模糊邏輯控制(fuzzy logic control)部分依賴于數學生長模型，也采用“語言定義的規則系統”(linguistically defined rules system)來幫助系統響應發酵過程的非線性和動態行為。Alfafara等在流加培養釀酒酵母生產谷胱甘肽的研究中，采用一個模糊邏輯控制系統來控制葡萄糖的流加速度，對系統進行優化后谷胱甘肽的比產生速率達到6.2 h-1。目前，在流加培養中應用模糊邏輯控制技術的最大問題在于如何減少底物和產物濃度振蕩所需的調整次數。自適應模糊邏輯控制算法的發展可望對此有所幫助。

   (三)誘導策略

對于許多帶有誘導型啟動子的重組微生物，只有將生長期和產物形成期分開才能獲得最大生產率。在流加培養中，這兩段時期的分離可以通過延遲誘導直至細胞生長已達到高密度來實現。此外，如果質粒穩定并且產物對培養物無毒，那么可以用重復補料分批培養系統來提高生產率。有學者采用重復補料分批培養技術培養釀酒酵母，每24 h更換50%的培養基，持續30 d，其產物(hirudin)的產量可比連續培養系統提高3倍。

如果誘導物和產物對細胞都有毒性，那么應當人為地將誘導期和生長期分開。對于這種情況，兩級連續培養是最適宜的培養方式。控制第一罐的條件，使細胞生長處于最適狀態之下，而誘導與產物形成則發生在第二罐中。例如，在恒化器中培養一株能產b-內酰胺酶的重組大腸桿菌，將第一罐的發酵液導入第二罐中，構成一個兩級培養系統。第二罐中添加營養物以及IPTG作為誘導物。結果獲得300 mg活性b-內酰胺酶(相當于總蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。這一系統至少可以穩定運行50 d。另一相似的系統被用于培養大腸桿菌生產重組蛋白A-EcoRI蛋白融合體。培養在恒濁器中進行，對第二罐進行熱誘導，結果獲得了比分批發酵高6倍的比生產率。研究者還嘗試將生產重組蛋白的兩級連續培養系統與親和色譜柱相組合，試圖實現重組蛋白生產和純化的連續化。但由于技術上的一些原因，這種組合還未得到成功。
比生長速率對細胞生長和產物形成均有重要作用。經常會遇到的情況是，最適于細胞生長的比生長速率卻并不適于產物的形成或其它特性的實現。我們在培養面包酵母時發現，比生長速率為0.2 h-1時細胞產率最高，而比生長速率為0.178 h-1時酵母發酵活力最佳。針對這一現象我們提出了一個兩階段控制比生長速率的流加培養策略，結果在一個反應器中實現了高發酵活力與高細胞產率的統一。 (四)細胞循環發酵 從反應器角度來考慮獲得高細胞密度，通常采用的是細胞循環生物反應器。這種反應器利用一種切向流或中空纖維過濾器從醪液中分離細胞，細胞返回容器，無細胞醪液則以給定速率連續轉移，同時代之以新鮮培養基。利用細胞循環技術，可使細胞保留在反應器中并達到高細胞密度，而毒性廢產物和胞外產物則不斷轉移，這可以延遲或防止由細胞生長或產物形成引起的反饋抑制。細胞循環生物反應器能夠適用于多種機體和生產系統，但它的應用也存在許多限制，主要包括∶(1)作用于進入過濾單元的細胞的剪應力太大；(2)系統的放大存在許多實際困難。
操作細胞循環生物反應器時必須考慮兩個因素，一是稀釋率(流速／體積)；二是循環速率(指通過過濾系統的培養基速率)。稀釋率的大小影響細胞的生長速率，不同的實驗目的對稀釋率的要求也不同；高的循環速率可使組分混合均勻，特別適用于細胞容易凝聚或成團的情況。但循環速率過高會使作用在細胞上的剪切力過高，也會導致過濾單元膜的迅速損壞。因此，很難同時確定合適的稀釋率與循環速率，這也是限制細胞循環技術應用的一個重要因素。
細胞循環技術可望獲得高的體積生產率，這對產物的提取非常有利。近年來循環發酵技術已廣泛用于生產細胞代謝物，如燃料酒精和有機酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用細胞循環發酵技術，重組大腸桿菌細胞干重達到145 g/L，其重組青霉素酰化酶生產率比分批培養提高了近10倍。對于活細胞即為所希望的產物的培養，細胞循環發酵也能發揮作用。如在食品工業中，為生產牛奶，奶酪和酸乳酪需培養不同的乳桿菌，采用細胞循環生物反應器可以很容易地提高這些生物體的的密度。
在多種控制手段的幫助下，目前人們已經能很容易地獲得超過100 g/L的細胞密度。但已有的研究結果表明，與最適生物量形成所對應的生長條件通常會導致較低的比生產率。例如，用細胞循環反應器生產2,3-丁二醇，生物量提高了大約6倍，但體積生產率只提高了2～3倍。同樣，流加培養可以使鏈霉菌的細胞干重達到43 g/L，但蛋白酶活為零，而當細胞干重為18 g/L時蛋白酶活卻高達3500 U/mL。我們在研究中也經常遇到類似問題。要解決這一問題，一方面應當研究如何促進重組蛋白的高效表達和提高重組菌株的穩定性，另一方面要研究與高細胞密度相關聯的高水平產物的形成條件。